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LNA合成・BNA合成

LNA合成概要

LNAは安定性と相補鎖への特異性に優れた人工核酸の一種です。弊社は、LNAオリゴ合成の豊富な経験と実績を有しております。長鎖DNA-LNAキメラオリゴの他に、ホスホロチオエート化、末端修飾など、DNA合成と同様に様々な修飾を行う事も可能です。

LNA合成概要

特長

LNAとは

Locked Nucleic Acid の略で、デンマークExiqon社よりライセンスを受けて、研究開発用途として弊社より供給させていただいております。

天然核酸(DNAやRNA)は化学構造上形の自由度(コンフォメーションの自由度)が大きくなっております。そのためDNA-DNA、RNA-RNA間の二重鎖形成(ハイブリダイズ)において熱力学的に不利となっており、結合親和性(ハイブリダイズ能)を改善する事が人工核酸創成の課題となっております。LNAは、天然核酸の“形の自由度”を拘束することにより(下図赤線表示の構造)、標的となるDNAやRNAに対する結合親和性を高め、かつヌクレアーゼ(核酸分解酵素)耐性をも獲得する架橋構造を核酸分子内に持つという、これまでの人工核酸と異なるコンセプトで設計されました。

これらLNAを天然型オリゴヌクレオチドの中に部分的に組み込んだLNA修飾オリゴマーは、一本鎖DNAやRNAへの特異的相補鎖形成能を格段に向上させます。

Fig.1 LNAの構造 左がBNA(基本構造)、中がLNA(2’,4’-BNA)、右が天然型RNA

データ
  • LNAを天然型オリゴヌクレオチドの中に部分的に組み込んだLNA修飾オリゴマーは、一本鎖DNAやRNAへの特異的相補鎖形成能を格段に向上させます。

    Data 1. LNAを含むオリゴヌクレオチドはRNA,DNAに対し高い結合能をもつ

    Base

    LNAは左図のように糖部分を”揺るぎない”N型に固定

    ・RNAと同じ構造になるためRNAへの結合力が大幅に増加
    ・LNAの構造はDNAへの結合力増加にも寄与

    RNA結合親和性へのLNA挿入の効果 DNA結合親和性へのLNA挿入の効果

    Tm;DNA、RNAへの結合親和性を示す指標値
    →値が高いほど親和性増大
    LNAの挿入→Tm値の上昇→RNA, DNAへの結合力増加

    ヌクレオシドは、N型とS型の2種類の構造(「ゆらぎ」をもつという)をとり得ますが、LNAは、リボース環の2’位と4’位を架橋することによって「ゆらぎ」を抑え、完全にN型に固定されています。
    二本鎖RNA中のヌクレオシドはN型構造をとるので、予めN型構造に固定された核酸は、標的RNAに対して高い配列特異的結合能を有すると考えられます。

  • LNAを部分挿入したオリゴヌクレオチドは、天然型オリゴヌクレオチドに比べて優位なヌクレアーゼ耐性を獲得しております。

    Data 2.LNAを含むオリゴヌクレオチドは高い核酸分解酵素耐性を有している

    (実験例 )LNA挿入オリゴヌクレオチド、S-オリゴヌクレオチド、天然型オリゴヌクレオチドの核酸分解酵素への耐性

    図3. LNA挿入オリゴヌクレチオドの核酸分解酵素耐性

    LNA挿入による核酸分解酵素耐性の強化

    生体内での安定性向上が期待される

    LNAを挿入することで、天然型オリゴヌクレオチドに比べてLNA-オリゴは核酸分解酵素への耐性が向上することから、体内での安定性が改善される可能性が高くなっています。このことは動物細胞、実験動物を用いた実験において、従来より少量でオリゴの効果(アンチセンス、アンチジーン、siRNA)の持続を期待できます。

  • 従来からアンチセンスオリゴヌクレオチドに利用されているホスホロチオエート型オリゴマー(S-オリゴ)とLNAオリゴマーをin vivo実験で比較した場合、LNAオリゴマーの方が高い安全性をもつ可能性を示唆する報告もされております。

    Data 3.動物実験におけるLNAの優位性

    (研究例 )LNA antisense をラットに投与しても毒性を示さない。

    この研究ではラットの脳に天然型 oligo(DNA)、S-oligo (PS)、LNA-oligo(LNA)を投与した場合の生体反応を見ている。投与オリゴに生体毒性がある場合は、発熱反応を引き起こす。

    • DNA PS

      S-オリゴ(PS)の投与によって、コントロールの天然型オリゴ(DNA)投与に比べて明確な発熱反応を示した。

    • DNA LNA

      LNA-オリゴを投与してもコントロールの天然型オリゴ(DNA)と比較して発熱反応を示さなかった。

    LNA-oligoは生体毒性を引き起こしにくい安全な核酸である可能性を示しています。

    Wahlestedt ら, (2000) PNAS 97, 5633-5638 より抜粋

    動物実験においてLNA-オリゴの安全性を確認した例が報告されています。(Wahlestedtら、PNAS.vol97.p5633-5638、)。この報告では、脳にS-オリゴを注入されたラットが明らかな発熱反応を示し、このラットの脳の病理組織像において神経細胞の脱落が見られるのに対し、LNA-オリゴを注入されたラットでは、このような病理所見が見られません。これらにより、LNA-オリゴは、S-オリゴよりも医薬として安全であるといえます。

弊社ではBNAの一種であるLNAを様々な組み合わせでオリゴヌクレオチドとして合成・精製する技術を確立しております。
また、末端修飾、大量合成、in vivo 実験用グレードでの出荷等にも対応いたします。

LNAオリゴヌクレオチドについて

株式会社ジーンデザインのLNAオリゴヌクレオチドは、Exiqon社(デンマーク)と株式会社ジーンデザイン(日本)とのライセンス契約に基づき、研究開発での利用を目的として日本国内で製造されたものです。

価格

  • ※各種蛍光および末端修飾の対応が可能です。(価格は上記PDFをご参照ください)
  • ※LNA/BNAの割合が2/3以上の配列は納品量が通常の保証量の半分程度になる場合がございますので予めご了承をお願い致します。
  • ※10塩基以下の配列は保証量が異なる場合がございます。
  • ※Alexa Fluor®蛍光色素シリーズは488,532,546,594,647,750が標準となります。
    他の波長の製品をご希望の場合は、お問い合わせ下さい。

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